Конфокальная флуоресцентная микроскопия

Одним из методов современной оптической микроскопии является конфокальная флуоресцентная микроскопия. Преимущества данного метода по сравнению с методами классической микроскопии действительно вызывают восторг. Трехмерное изображение, которое получают с помощью конфокального микроскопа, дает возможность:

• наблюдать объект исследования с высоким разрешением в различных плоскостях;
• изучать внутреннюю структуру клеток, в том числе живых;
• исследовать развитие клеток и молекул в динамике, наблюдать их структурное изменение в настоящем времени.

Запатентованный в 50-х годах метод конфокальной микроскопии принадлежит американскому профессору биологии Марвину Минскому. Применяя флуоресцентный микроскоп в своих исследованиях Марвину было необходимо увеличить контрастность в толстых тканях образца. Так конфокальная микроскопия получила свой первый толчок в развитии. В дальнейшем времени конфокальная схема все чаще применялась и активно модифицировалась различными учеными мира.

Впервые официальная научная работа по изучению конфокального микроскопа появилась в 1977 году.

Особенности и принцип конфокальной микроскопии

Выделяют такие основные особенности применения конфокального микроскопа:

1. Конфокальный микроскоп позволяет формировать полное изображение объекта исследования с помощью фильтрации внефокусных лучей конфокальной диафрагмой, за счет чего увеличивается контрастность изображения. От выбора размера диафрагмы зависит количество проходящего света в фокальной плоскости, что в свою очередь влияет на контрастность полученного изображения. С помощью нее удается не только получить качественное изображение, но и, изменяя ее диаметр, вычислить толщину оптического слоя вблизи луча лазерного света. Это дает возможность устранить конфокальные лучи, излучаемые выше и ниже лазерного фокуса и не регистрировать их. Именно это и является отличительной и главной особенностью конфокальных микроскопов от всех остальных.
2. Высокая разрешающая способность конфокального микроскопа, которая достигается с помощью лазерных источников света.
3. В случае исследования толстых образцов можно использовать последовательные оптические срезы. В таком случае толщина образца больше, чем фокальная плоскость.
4. Имеется возможность одновременного исследования нескольких образцов.
5. Применение конфокального микроскопа позволяет исследовать биологические процессы в живых тканях и клетках.

Конфокальная микроскопия характеризуется такими принципами:

• Принцип конфокальной фильтрации флуоресценции. Данный принцип основывается на том, что лишь свет, отраженный от объекта исследования в фокусной плоскости, пройдет обратно через линзу, и может образовать изображение.
• Под конфокальным микроскопом исследование проводят посредством сканирования объекта с помощью лазерного источника освещения. Таким образом, достигается формирование изображения, которое выводится на монитор компьютера.

Отличия конфокального микроскопа от обычного оптического микроскопа

1. Источником света обычного микроскопа служит ртутная или ксеноновая лампа. В конфокальном же микроскопе используется в основном лазер (в некоторых случаях – светодиодная лампа). Пучок света под воздействием лазера практически не расходится, а сконцентрирован параллельно. Такое отличие позволяет получить изображение в разы качественнее, с отсутствием бликов, а также увеличить эффективность работы оптической системы конфокального лазерного микроскопа. Следует отметить, что разрешающая способность конфокального микроскопа в сравнении с обычным микроскопом превышает примерно в 1,5 раза.
2. В отличие от обычного микроскопа, в котором исследуемый объект можно увидеть в объективе устройства, изображение образца конфокального микроскопа можно наблюдать лишь на экране компьютера.
3. Цифровой результат исследования конфокального микроскопа – это трехмерная или четырехмерная модель объекта, полученная в несколько секунд. Кроме того такой результат можно в дальнейшем обработать с помощью специального программного обеспечения, сохранить в базе данных компьютера, а также провести необходимый анализ исследования.

Сфера применения конфокального микроскопа

Роль конфокальной микроскопии среди нашего населения достаточно велика. Но если говорить об основных ее задачах, то всех их можно выделить в три основные группы: структурное изучение клеток, взаиморасположение в структуре клетки различных веществ, изучение всех процессов, происходящих в ней. Как было уже сказано выше, именно за счет разрешения высокого уровня микроскопов, а также благодаря возможности осуществить серию срезов клетки, можно провести трехмерное исследование клетки. Благодаря технологиям развития и компьютерным технологиям, с помощью них удается посмотреть любой изучаемый объект в трехмерном измерении, так называемое изображение 3D, а также исследовать клетку под разными углами. Такое свойство и особенность конфокальных микроскопов позволяют детально изучить форму клетки, ее скелет, ядро, его структуру, строение и структуру хромосом с изучением отдельных генов.

Основными направлениями развития конфокальной микроскопии являются следующие:

1. Биология, в том числе гидробиология, зоология и ботаника – применение конфокального микроскопа дает возможность наблюдать и изучать различные клеточные процессы, создавать гибриды различных культур. Изучение количества и состава примесей в воде с применением конфокального микроскопа сегодня стало особенно актуальным
2. Медицинская деятельность в сфере диагностики – получение результатов лабораторных исследований и постановка диагноза пациентам. Кроме того диагностическая конфокальная микроскопия позволяет выявить нарушения в клетках и обнаружить различные заболевания, в том числе онкологические, уже на ранних стадиях их развития. Широко применяется конфокальный метод диагностики по таким направлениям, как: офтальмология, проктология, дерматология. Особое место и роль конфокальная микроскопия занимает в изучении лимфаденопатии, ведь путем биопсии лимфатического узла без проведения какого – либо окрашивания и изучения срезов, можно увидеть структуру клетки – нормальная ткань или злокачественная. Это является на сегодня передовым, самым простым и доступным методом диагностики злокачественного процесса в лимфатических узлах.
3. Фармацевтическая деятельность – конфокальный микроскоп дает возможность разрабатывать новые лекарственные препараты.
4. Эмбриология – конфокальный микроскоп позволяет наблюдать стадии эмбрионального развития живого организма.
5. Различные технические исследования.
6. Научно – исследовательская деятельность.

В развитии области фармакологии и диагностической медицины конфокальный микроскоп сыграл особую роль. Следует отметить, что применение конфокального микроскопа в вышеуказанной сфере деятельности сегодня позволяет:

• определять влияние определенных веществ и их количество в цитоплазме или других частях клетки;
• выявить наличие продуктов метаболизма в организме;
• сравнить интенсивность процесса метаболизма при различных условиях;
• определить, как быстро выводятся вещества из клетки;
• определить степень влияния канцерогенов на клетки организма человека;
• четко определить оптимальную концентрацию того или иного медицинского препарата;
• исследовать влияние противоопухолевых лекарственных препаратов на клетки организма;
• выявлять и отличать клетки воспалительного характера от нормальных клеток (широко применяется на ранней стадии диагностики рака шейки матки);
• упростить процесс биопсийного исследования лимфоузлов в случае определения злокачественной ткани.

Конфокальный микроскоп: принцип работы

Чтобы понять принцип работы конфокального микроскопа, следует знать, что он состоит из следующих основных устройств:

1. микроскоп;
2. цифровая камера;
3. блок лазеров;
4. модуль Z-сканирования;
5. модуль синхронизации;
6. конфокальный блок.

Кроме того в комплектацию конфокального микроскопа входит специальное программное обеспечение, которое позволяет:

• совершить необходимые настройки изображения;
• управлять настройками и функциями самого микроскопа;
• обрабатывать и хранить архив полученных изображений в процессе исследования.

Помимо стандартного программного обеспечения имеется возможность применения дополнительного пакета приложений.

Как же происходит процесс исследования с применением конфокального микроскопа?

1. Вначале с помощью объектива микроскопа фокусируется лазерный луч на поверхность исследуемого объекта. При этом лазерный свет возбуждает процесс флуоресценции (свечение веществ и соединений).
2. Используя сканирующее устройство, происходит процесс сканирования образца.
3. Результат сканирования выводится на экран компьютера в течение нескольких секунд.
4. Проводится компьютерная обработка (оцифровка) изображения, позволяющая максимально точно изучить объект исследования. Получаемое изображение называют оптическим срезом. То есть такое изображение образуется вследствие световой фокусировки, а не физического воздействия на образец исследования. Также важно отметить, что при исследовании можно получить трехмерное изображение, которое образуется в результате серии последовательных изображений с заданным временным интервалом.

Методы, применяемые в конфокальной микроскопии

1. Метод флуоресценции (метод контрастирования). Данный метод обеспечивает получение изображения образца с большей контрастностью, таким образом, облегчая процесс исследования. Чтобы молекула начала излучать свет, необходимо, чтобы он вначале поглотился ею (переход молекулы в возбужденное состояние). Когда молекула возвращается из возбужденного в обычное состояние, то происходит процесс излучения (флуоресценция).
2. Отражательный метод конфокальной микроскопии в отличие от метода контрастирования, не требует предварительной подготовки препарата (контраста), и основывается на различии показателей индекса преломления света внутри исследуемого объекта. То есть в процессе микроскопического исследования применяется точечный источник света, в основном это лазер. В данном случае факторы, влияющие на качество полученного изображения, – это:

• апертура линзы объектива (способность оптической линзы собирать свет);
• размер линзы;
• длина световой волны, которая чем длиннее, тем выше способность проникать внутрь образца; при этом снижается разрешение изображения, в отличие от влияния коротких волн.

Преимущества и недостатки конфокального микроскопа

Среди преимуществ использования конфокального микроскопа можно выделить следующие:

1. Получение качественного изображения результата исследования, исключая фоновые засветки.
2. Отмечается высокая разрешающая способность и контрастность получаемого изображения образца.
3. Имеется возможность получать серию последовательных изображений тонких срезов образца при его большой толщине.
4. Возможность контроля глубине фокуса исследуемого образца.
5. Компьютерная обработка, анализ и хранение полученных изображений.

Основные недостатки применения конфокального микроскопа:

1. Сложность устройства микроскопа и необходимость иметь навыки его управлением.
2. Невозможность наблюдения оптического изображения исследуемого образца в объектив конфокального микроскопа; возможно получение только цифрового изображения.
3. Высокая стоимость конфокального устройства делает его доступным далеко не каждому.

Перспектива дальнейшего развития конфокальной микроскопии: основные аспекты

• На сегодняшний день большим достижением считается практическое применение метода конфокальной микроскопии в диагностике и наблюдении патологий роговицы глаза. Высокая разрешающая способность конфокального микроскопа в данном случае позволяет оценить степень офтальмологических нарушений, а также эффективность применяемого лечения либо хирургического вмешательства. Поэтому дальнейшее изучение живых клеток тканей роговицы конфокальным методом является очень актуальным.
• Не менее перспективным также считается применение конфокальных исследований в области эндоскопии, то есть возможность мгновенного получения изображения гистологического анализа тканей и внутренних органов.
• Постоянная модернизация функциональных характеристик конфокального микроскопа позволяет проводить нейробиологические исследования, в том числе сосудов головного мозга.
• Фильтрация воды, а также ее качественные характеристики м ее состав – это еще одно актуальное направление развития конфокальной микроскопии сегодня.
• Важность применения конфокального микроскопа в современных исследованиях диагностических лабораторий трудно даже оценить.
• Стремительное развитие компьютерных технологий, и модификации конфокальных микроскопов смогут решить многие исследовательские задачи.

Учитывая многочисленные преимущества конфокальной микроскопии, можно сказать, что конфокальный микроскоп – это важное достижение оптической микроскопии, которое активно продолжает свое развитие и играет значимую роль в жизни и здоровье человека. Любая модель конфокального микроскопа позволит проводить максимально качественные и точные исследования во многих областях его применения.